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Volume de comunicações da natureza

Nature Communications volume 13, Número do artigo: 4695 (2022) Citar este artigo

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2 Citações

221 Altmétrico

Detalhes das métricas

Proteínas de seda de aranha recombinantes (espidroínas) têm múltiplas aplicações potenciais no desenvolvimento de novos biomateriais, mas sua natureza multimodal e propensa à agregação tem produção complicada e aplicações diretas. Aqui, relatamos que as espidroínas em miniatura recombinantes, e também o domínio N-terminal (NT) por conta própria, formam rapidamente hidrogéis autossustentáveis ​​e transparentes a 37 ° C. A gelificação é causada pela NT α-hélice para conversão de folha β e formação de fibrilas semelhantes a amilóide, e proteínas de fusão compostas de NT e proteína verde fluorescente ou purina nucleosídeo fosforilase formam hidrogéis com funções intactas das porções de fusão. Nossos resultados demonstram que NT recombinante e proteínas de fusão fornecem altos rendimentos de expressão e conferem propriedades atraentes aos hidrogéis, por exemplo, transparência, gelificação livre de reticulador e imobilização direta de proteínas ativas em alta densidade.

As aranhas têm até sete conjuntos diferentes de glândulas de seda, cada uma produzindo um tipo específico de seda. Todas as sete sedas são compostas por proteínas de seda de aranha (espidroínas) com até ~ 6.000 resíduos de comprimento e contêm uma extensa região repetitiva central coberta por domínios globulares N- e C-terminal (NT e CT)1,2. O tipo de seda mais extensivamente estudado, a ampola maior, é produzida pela glândula ampola maior. Nessa glândula, um epitélio de camada única sintetiza as espidroínas e as secreta no lúmen da glândula, onde são armazenadas na forma solúvel (dope) em concentrações extremamente altas (30-50% p/v)3,4. A organização e conformação das principais espidroínas ampuladas na glândula têm sido debatidas, mas a maioria das evidências experimentais aponta para uma conformação helicoidal e/ou espiral aleatória geral e a existência de micelas ou estruturas semelhantes a flocos5,6,7,8,9, 10. Enquanto a região repetitiva medeia as propriedades mecânicas da fibra de seda formando nanocristais de folha β e estruturas amorfas11,12,13,14,15, os domínios terminais controlam a formação de seda respondendo a condições alteradas ao longo da glândula de seda16,17,18, 19. Os domínios terminais são conservados evolutivamente e sua função é provavelmente universal em todas as espidroínas2,20,21. Durante a passagem pela glândula, as espidroínas experimentam uma queda no pH de cerca de 7,6 para < 5,716 e aumento das forças de cisalhamento e extensão mediadas pelo movimento através do ducto que se estreita progressivamente22. Em solução, a CT é um dímero constitutivo paralelo α-helicoidal17, mas em resposta a pH baixo e forças de cisalhamento, a CT sofre desdobramento e conversão de folha-β16,17, possivelmente desencadeando a transição de folha-β da região repetitiva16. A NT é monomérica em condições que refletem aquelas no lúmen da glândula e medeia a solubilidade para as espidroínas, mas em pH reduzido, a protonação de uma série de cadeias laterais de carboxilato leva à dimerização da NT com um pKa de cerca de 6,5, que estabiliza a NT e bloqueia as espidroínas em grandes redes16,18. Assim, o NT desempenha um papel fundamental no processo de formação da seda, passando de um monômero no dope para um dímero na fibra23,24,25. A NT permanece altamente solúvel e helicoidal em todas as condições investigadas até o momento16,18,19,20,26,27,28,29, o que inspirou seu desenvolvimento em um marcador de aumento de solubilidade para a produção de proteínas heterólogas30.

Uma mini-espidroína recombinante composta por um NT, uma região de repetição curta, um CT e um marcador His6 para purificação (His-NT2RepCT), é tão solúvel quanto proteínas nativas de seda de aranha em tampões aquosos e recapitula características importantes da aranha nativa droga de seda25,31. O His-NT2RepCT pode ser fiado em fibras contínuas usando configurações biomiméticas onde o dope solúvel em pH 8 é extrudado em um banho aquoso de pH 525,32,33,34,35. A fermentação em biorreator de Escherichia coli expressando His-NT2RepCT e o subsequente processamento a jusante resultam em um rendimento de >14 g/l após purificação34. Ambos os altos rendimentos de His-NT2RepCT, sua alta solubilidade e resposta adequada a condições ácidas têm sido atribuídos ao NT23,25,34.

 50 mg/ml the NT solution gels faster than His-NT2RepCT at the corresponding concentration (w/v, Fig. 1c)./p> 70% of the initial fluorescence intensity remains after gelation (Fig. 6a). To measure the activity of PNP in his-NT-PNP solutions and gels, we had to dilute the fusion protein with NT as the enzymatic activity of a pure preparation at concentrations relevant for gel formation was outside the detection range of the assay. Mixtures containing 0.01 mg/ml His-NT-PNP and 100 mg/ml NT formed gels that retained 65% of the initial enzymatic activity of preincubated sample (Fig. 6b). Gels remained intact during the measurements (Supplementary Fig. 10)./p>200 mg/ml at 4 °C for days27. Furthermore, NT readily refolds after thermal denaturation at low µM protein concentrations16,18,27. According to our results, a combination of a protein concentration of >10 mg/ml and slightly increased temperatures are necessary for fibril formation (Fig. 1). This is in line with the notion that amyloid fibrils can form from globular folded proteins that expose locally unfolded states via thermal fluctuations under physiological conditions48. Examples of proteins that undergo such conversion include insulin49,50, β2-microglobulin, transthyretin and lysozyme51,52,53. Although NT in its native state is α-helical, circa 65% of the polypeptide chain is compatible with steric zipper formation (Fig. 4e)45. Since the monomer is dynamically mobile46 it could expose these potentially amyloidogenic regions at moderately increased temperatures and, at high total protein concentrations, may reach critical concentrations for amyloid fibril formation54. In line with this reasoning, we found that spidroin concentration is negatively correlated to gelation time (Fig. 1c), and that if the conformation of the monomer NT is stabilized, i.e., by mutations (NT*, His-NT-L6) or by addition of salt, hydrogel formation is prevented (Fig. 5)./p> 300 mg/ml (30%) outperform all other reported recombinant spider silk protein hydrogels as well as natural hydrogels such as gelatin, alginate (2%), agar (0.5%) and collagen (0.6%) in terms of mechanical properties (Fig. 7 and Supplementary Tables 1 and 3)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74./p>10 mg/mL), NT forms gels composed of amyloid-like fibrils. Also NT fusion proteins form fibrillar gels with intact function of the fusion moiety, which makes it possible to use NT for immobilization of various proteins in three dimensional hydrogels. Lower panel: NT (PDB: 4FBS) and illustrations of the fibrillar network and associated protein structures (hypothetical and not to scale, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb)./p> 100 mg/ml were thawed on ice and filtered through 0.22 μm filters. The concentration was calculated by measuring the absorbance at 280 nm, using a Nanodrop. The samples were diluted to 20 mg/ml in 20 mM Tris-HCl pH 8 in a well of a black non-binding surface 96-well plate with clear bottom (Corning) and mixed with 5 μM ThT (final concentration) in a total sample volume of 50 μl. Samples were imaged every 10 min at 37 °C on a CellObserver microscope (Zeiss) with the transmitted light channel and with FITC excitation and emission filter sets for ThT imaging. 20x/0.4 objective lens was used for imaging. Zen Blue (Zeiss) and ImageJ (https://imagej.nih.gov/) was used for image analysis. Gels were also made from solutions of NT and His-NT2RepCT at 50 mg/ml in 20 mM Tris pH 8 with 5 µM ThT by incubation at 37 °C for 90 min. Pieces of the gels were transferred to a new well containing 20 mM Tris pH 8 and 5 µM ThT in a non-binding black 96-well plate with clear bottom. Green fluorescence and brightfield images were acquired at 20x/0.4. ImageJ was used for image analysis./p>

3.0.CO;2-N" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-4636%28199910%2947%3A1%3C46%3A%3AAID-JBM6%3E3.0.CO%3B2-N" aria-label="Article reference 71" data-doi="10.1002/(SICI)1097-4636(199910)47:13.0.CO;2-N"Article CAS PubMed Google Scholar /p>