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Mar 16, 2023

Tipo de célula

Volume de comunicações da natureza

Nature Communications volume 13, Número do artigo: 2927 (2022) Citar este artigo

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O perfil proteômico de tipos de células cerebrais usando estratégias baseadas em isolamento apresenta limitações na resolução de fenótipos celulares representativos de seu estado nativo. Descrevemos uma linha de camundongos para a expressão específica do tipo de célula da biotina ligase TurboID, para biotinilação in vivo de proteínas. Usando abordagens adenovirais e transgênicas para rotular neurônios, mostramos uma robusta biotinilação de proteínas em soma neuronal e axônios em todo o cérebro, permitindo a quantificação de mais de 2.000 proteínas derivadas de neurônios, abrangendo proteínas sinápticas, transportadores, canais iônicos e alvos drogáveis ​​relevantes para doenças. Em seguida, contrastamos os proteomas de neurônios Camk2a e astrócitos Aldh1l1 e identificamos diferenças proteômicas específicas da região cerebral em ambos os tipos de células, algumas das quais podem potencialmente estar por trás da vulnerabilidade seletiva a doenças neurológicas. Aproveitando a especificidade celular da rotulagem proteômica, aplicamos uma abordagem baseada em anticorpos para descobrir diferenças nas fosfoproteínas e citocinas de sinalização derivadas de neurônios e astrócitos. Esta abordagem facilitará a caracterização de proteomas específicos do tipo de célula em um número diverso de tecidos em estados fisiológicos e patológicos.

O cérebro é composto por tipos celulares distintos, incluindo neurônios, glia (astrócitos, oligodendrócitos, micróglia) e células vasculares (células endoteliais e pericitos). Os tipos de células cerebrais demonstram mudanças complexas e diferenciadas em sua composição molecular (DNA, mRNA, proteína) durante processos fisiológicos no desenvolvimento, envelhecimento e em estados patológicos1. Avanços recentes no perfil transcriptômico de células únicas e em massa de estados saudáveis ​​e patogênicos de camundongos e cérebros humanos forneceram vários novos insights sobre diversas assinaturas moleculares adotadas por tipos de células cerebrais2. Especificamente, eles destacaram várias respostas celulares neuronais e gliais causais em doenças neurológicas; no entanto, os achados transcriptômicos correlacionam-se apenas modestamente com alterações no nível de proteína (proteômicas)3,4,5,6. As proteínas também sofrem modificações pós-traducionais que afetam sua função e perfis de expressão quantitativa, temporal e espacialmente; uma característica não refletida pela abundância de transcrição3,5,6. Portanto, a caracterização proteômica de diferentes tipos de células cerebrais pode fornecer informações importantes sobre os mecanismos celulares de desenvolvimento, envelhecimento e neuropatologia.

O perfil proteômico de tipos de células cerebrais requer o isolamento de células intactas de cérebro fresco não congelado, um pré-requisito que não é necessário para estudos transcriptômicos de núcleo único de núcleos intactos de cérebro congelado7,8. Existem vários métodos pelos quais células vivas relativamente puras de interesse podem ser isoladas com contaminação mínima e alta sensibilidade. Por exemplo, classificação de células ativadas por magnetismo (MACS) e seleção de células ativadas por fluorescência (FACS) foram usadas para isolar um ou mais tipos de células cerebrais para proteômica baseada em espectrometria de massa (MS)9,10. No entanto, esses métodos não são isentos de limitações, incluindo rendimento celular variável, baixo rendimento de proteínas, contaminação celular e acelular, viés de amostragem e ativação celular artificial, que impactam significativamente os perfis proteômicos desses tipos de células9. Além disso, estudos proteômicos baseados em isolamento da glia também são suscetíveis a viés de amostragem e não conseguem capturar assinaturas moleculares representativas de seu estado nativo. Vários estudos caracterizaram o proteoma de sinapses de tecidos cerebrais de camundongos e humanos11,12; no entanto, os neurônios vivos do tecido cerebral fresco são particularmente difíceis de isolar, inerentemente limitando nossa capacidade de entender as alterações proteômicas específicas do neurônio que ocorrem in vivo.

Recentemente, abordagens de rotulagem transcriptômica específica do tipo de célula in vivo (por exemplo, RiboTag) foram desenvolvidas para quantificar os transcritos sem a necessidade de isolamento celular13,14,15. Análoga a essas abordagens, a rotulagem proteômica in vivo foi obtida por marcação bioortogonal de aminoácidos não canônicos (BONCAT), em que uma estratégia genética Cre-lox leva à expressão condicional do mutante (L274G) metionil tRNA sintetase (MetRS*) em um tipo específico de célula no cérebro do camundongo16. MetRS* incorpora um análogo da metionina, azidonorleucina (Anl), em proteínas recentemente sintetizadas no lugar da metionina no tipo de célula desejado16,17,18,19. Proteínas marcadas com Anl podem então ser enriquecidas usando a química "Click" de azida-alcino seguida por quantificação de MS19. Até o momento, o BONCAT in vivo foi aplicado com sucesso para caracterizar o proteoma neuronal nascente e é adequado para estudar a renovação de proteínas recém-sintetizadas, potencialmente também em células não neuronais16,17. A proteômica específica da sinapse in vivo também foi alcançada usando a abordagem condicional de purificação de afinidade em tandem Cre-lox PSD95 (cPSD95-TAP)20.